山梨酸、苯甲酸的测定方法
1主题内容与适用范围
本标准规定了酱油、水果汁、果酱等食品中山梨酸、苯甲酸含量的测定方法。
本标准适用于酱油、水果汁、果酱等食品中山梨酸、苯甲酸含量的测定。
最低检出浓度：气相色谱法最低检出量为1μg，用于色谱分析的样品为1g时，最低检出浓度为1mg/kg。
第一篇气相色谱法(第一法)
2原理
样品酸化后，用乙醚提取山梨酸、苯甲酸，用附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较定量。
3试剂
3.1乙醚：不含过氧化物。
3.2石油醚：沸程30～60℃。
3.3盐酸。
3.4无水硫酸钠。
3.5盐酸(1＋1)：取100mL盐酸，加水稀释至200mL。
3.6氯化钠酸性溶液(40g/L)：于氯化钠溶液(40g/L)中加少量盐酸(1＋1)酸化。
3.7山梨酸、苯甲酸标准溶液：准确称取山梨酸、苯甲酸各0.2000g，置于100mL容量瓶中，用石油醚—乙醚(3＋1)混合溶剂溶解后并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于2.0mg山梨酸或苯甲酸。
3.8山梨酸、苯甲酸标准使用液：吸取适量的山梨酸、苯甲酸标准溶液，以石油醚－乙醚(3＋1)混合溶剂稀释至每毫升相当于50，100，150，200，250mg山梨酸或苯甲酸。
4仪器
气相色谱仪：具有氢火焰离子化检测器。
5分析步骤
5.1样品提取
称取2.50g事先混合均匀的样品，置于25mL带塞量筒中，加0.5mL盐酸(1＋1)酸化，用15，10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，将上层乙醚提取液吸入另一个25mL带塞量筒中。合并乙醚提取液。用3mL氯化钠酸性溶液(40g/L)洗涤两次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5mL乙醚提取液于5mL带塞刻度试管中，置40℃水浴上挥干，加入2mL石油醚－乙醚(3＋1)混合溶剂溶解残渣，备用。
5.2色谱参考条件
5.2.1色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长2m，内装涂以5%(m/m)DEGS＋1%(m/m)H3PO4固定液的60～80目ChromosorbWAW。
5.2.2气流速度：载气为氮气，50mL/min(氮气和空气、氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件)。
5.2.3温度：进样口230℃；检测器230℃；柱温170℃。
5.3测定
进样2μL标准系列中各浓度标准使用液于气相色谱仪中，可测得不同浓度山梨酸、苯甲酸的峰高，以浓度为横坐标，相应的峰高值为纵坐标，绘制标准曲线。
同时进样2μL样品溶液。测得峰高与标准曲线比较定量。
5.4计算
式中：X1——样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg；
m1——测定用样品液中山梨酸或苯甲酸的质量，μg；
V1——加入石油醚－乙醚(3＋1)混合溶剂的体积，mL；
V2——测定时进样的体积，μL；
m2——样品的质量，g；
5——测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；
25——样品乙醚提取液的总体积，mL。
由测得苯甲酸的量乘以1.18，即为样品中苯甲酸钠的含量。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
5.5允许差
相对相差≤10%。
5.6其他
在色谱图中山梨酸保留时间为2分53秒；苯甲酸保留时间为6分8秒。
（图略）
第二篇高效液相色谱法(第二法)
6原理
样品加温除去二氧化碳和乙醇，调pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。
7试剂
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度水，溶液为水溶液。
7.1甲醇：经滤膜(0.5μm)过滤。
7.2稀氨水(1＋1)：氨水加水等体积混合。
7.3乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL，溶解，经滤膜(0.45μm)过滤。
7.4碳酸氢钠溶液(20g/L)：称取2g碳酸氢钠(优级纯)，加水至100mL，振摇溶解。
7.5苯甲酸标准储备溶液：准确称取0.1000g苯甲酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL，加热溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，苯甲酸含量为1mg/mL，作为储备溶液。
7.6山梨酸标准储备溶液：准确称取0.1000g山梨酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL，加热溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，山梨酸含量为1mg/mL，作为储备溶液。
7.7苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各10.0mL，放入100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/mL。经滤膜(0.45μm)过滤(同时测定糖精钠时可加GB/T5009.28中3.4糖精钠标准储备溶液)。
8仪器
高效液相色谱仪(带紫外检测器)。
9分析步骤
9.1样品处理
9.1.1汽水：称取5.00～10.0g样品，放入小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水(1＋1)调pH约7。加水定容至10～20mL，经滤膜(0.45μm)过滤。
9.1.2果汁类：称取5.00～10.0g样品，用氨水(1＋1)调pH约7，加水定容至适当体积，离心沉淀，上清液经滤膜(0.45μm)过滤。
9.1.3配制酒类：称取10.0g样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水(1＋1)调pH约7，加水定容至适当体积，经滤膜(0.45μm)过滤。
9.2高效液相色谱参考条件
9.2.1色谱柱：YWG－C184.6mm×250mm10μm不锈钢柱。
9.2.2流动相：甲醇：乙酸铵溶液(0.02m0l/L)(5：95)。
9.2.3流速：1mL/min。
9.2.4进样量：10μL。
9.2.5检测器：紫外检测器，波长230μm，灵敏度0.2AUFS。
根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
9.3计算
式中：X2——样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
m3——进样体积中苯甲酸或山梨酸的质量，mg；
V4——进样体积，mL；
V3——样品稀释液总体积，mL；
m4——样品质量，g。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
9.4允许差：相对相差≤10%。
9.5其他
同GB/T5009.28的5.6。
注：本方法可同时测定糖精钠。
第三篇薄层色谱法(第三法)
10原理
样品酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。将样品提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开。显色后，根据薄层板上苯甲酸、山梨酸的比移值，与标准比较定性，并可进行概略定量。
11试剂
11.1异丙醇。
11.2正丁醇。
11.3石油醚：沸程为30～60℃。
11.4乙醚：不含过氧化物。
11.5氨水。
11.6无水乙醇。
11.7聚酰胺粉：200目。
11.8盐酸(1＋1)：取100mL盐酸，加水稀释至200mL。
11.9氯化钠酸性溶液(40g/L)：于氯化钠溶液(40g/L)中加少量盐酸(1＋1)酸化。
11.10展开剂。
11.10.1正丁醇＋氨水＋无水乙醇(7＋1＋2)。
11.10.2异丙醇＋氨水＋无水乙醇(7＋1＋2)。
11.11山梨酸标准溶液：准确称取0.2000g山梨酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于2.0mg山梨酸。
11.12苯甲酸标准溶液：准确称取0.2000g苯甲酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于2.0mg苯甲酸。
11.13显色剂：溴甲酚紫－乙醇(50%)溶液(0.4g/L)，用氢氧化钠溶液(4g/L)调至pH＝8。
12仪器
12.1吹风机。
12.2层析缸。
12.3玻璃板：10cm×18cm。
12.4微量注射器：10μL，100μL。
12.5喷雾器。
13操作方法
13.1样品提取
称取2.50g事先混合均匀的样品，置于25mL带塞量筒中，加0.5mL盐酸(1＋1)酸化，用15，10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，将上层醚提取液吸入另一个25mL带塞量筒中，合并乙醚提取液。用3mL氯化钠酸性溶液(40g/L)洗涤两次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。
加乙醚至刻度，混匀。吸取10.0mL乙醚提取液分两次置于10mL带塞离心管中，在约40℃的水浴上挥干，加入0.10mL乙醇溶解残渣，备用。
13.2测定
13.2.1聚酰胺粉板的制备：称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约7mL水，研磨3～5min，立即倒入涂布器内制成10cm×18cm、厚度0.3mm的薄层板两块，室温干燥后，于80℃干燥1h，取出，置于干燥器中保存。
13.2.2点样：在薄层板下端2cm的基线上，用微量注射器点1μL、2μL样品液，同时各点1μL、2μL山梨酸、苯甲酸标准溶液。
13.2.3展开与显色：将点样后的薄层板放入预先盛有展开剂(11.10.1或11.10.2)的展开槽内，展开槽周围贴有滤纸，待溶剂前沿上展至10cm，取出挥干，喷显色剂，斑点成黄色，背景为蓝色。样品中所含山梨酸、苯甲酸的量与标准斑点比较定量(山梨酸、苯甲酸的比移值依次为0.82，0.73)。
13.3计算
式中：X3——样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
m5——测定用样品液中苯甲酸或山梨酸的质量，mg；
V5——加入乙醇的体积，mL；
V6——测定时点样的体积，mL；
m6——样品质量，g；
10——测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；
25——样品乙醚提取液总体积，mL。
注：本方法还可以同时测定果酱、果汁中的糖精。
第四篇禁用防腐剂定性试验(第四法)
14硼酸、硼砂
14.1试剂
14.1.1盐酸(1＋1)：量取盐酸100mL，加水稀释至200mL。
14.1.2碳酸钠溶液(40g/L)。
14.1.3氢氧化钠溶液(4g/L)：称取2g氢氧化钠，溶于水并稀释至500mL。
14.1.4姜黄试纸：称取20g姜黄粉末，用冷水浸渍4次，每次各100mL，除去水溶性物质后，残渣在100℃干燥，加100mL乙醇，浸渍数日，过滤。取1cm×8cm滤纸条，浸入溶液中，取出，于空气中干燥，贮于玻璃瓶中。
14.2分析步骤
14.2.1样品处理
称取3～5g固体样品，加碳酸钠溶液(40g/L)充分湿润后，于小火上烘干、炭化后再置高温炉中灰化。量取10～20mL液体样品，加碳酸钠溶液(40g/L)至呈碱性后，置水浴上蒸干、炭化后再置高温炉中灰化。
14.2.2定性试验
14.2.2.1姜黄试纸法：取一部分灰分，滴加少量水与盐酸(1＋1)至微酸性，边滴边搅拌，使残渣溶解，微温后过滤。将姜黄试纸浸入滤液中，取出试纸置表面皿上，于60～70℃干燥，如有硼酸、硼砂存在时，试纸显红色或橙红色，在其变色部分熏以氨即转为绿黑色。
14.2.2.2焰色反应
取灰分置于坩埚中，加硫酸数滴及乙醇数滴，直接点火，硼酸或硼砂存在时，火焰呈绿色。
15水杨酸
15.1试剂
15.1.1三氯化铁溶液(10g/L)。
15.1.2亚硝酸钾溶液(100g/L)。
15.1.3乙酸(50%)。
15.1.4硫酸铜溶液(100g/L)。称取10g硫酸铜(CuSO4?H2O)，加水溶解至100mL。
15.2分析步骤
15.2.1样品提取
按GB/T5009.28中9.1操作，将乙醚提取液蒸干后，残渣备用。
15.2.2定性试验
15.2.2.1三氯化铁法：残渣加1～2滴三氯化铁溶液(10g/L)，水杨酸存在时显紫堇色。
15.2.2.2确证试验：溶解残渣于少量热水中，冷后加4～5滴亚硝酸钾溶液(100g/L)，4～5滴乙酸(50%)及1滴硫酸铜溶液(100g/L)，混匀，煮沸0.5h，放置片刻，水杨酸存在时呈血红色(苯甲酸不显色)。 （食品添加剂应用网）