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气相色谱-质谱联用内标法测定食用香精中的芝麻酚

    芝麻酚( Sesamol,SM) 是芝麻油抗氧化的主要成分,也是芝麻油重要的品质稳定剂。该物质具有较强的自由基清除能力,被广泛用于制备防霉抗菌剂、抗癌、抗高血压药品、高档洗发香波的头发调理剂等,是昂贵的化学、医药中间体原料,也是抗癌药物和农药增效剂合成的重要中间体,还可作为抗高血压和脑血管疾病药物的中间体[1 - 8]。但是,基于该物质的致肿瘤可能性,2006 年日本厚生劳动省将芝麻酚列入禁用的42 种食品添加剂名单[9]。国标GB2760 - 2011 《食品添加剂使用卫生标准》中也未将芝麻酚列入许可使用的食品添加剂名单。因此,为了规范食用香精的生产和使用,非常有必要建立该物质相应的配套检测方法,为监控和规范食用香精的使用提供技术支持。
    目前,芝麻酚的检测方法主要有薄层色谱法( TLC) 、高效液相色谱法( HPLC) 、气相色谱- 质谱联用法( GC - MS) 、红外光谱法( FTIR) 等[8 - 13],而定量分析普遍采用HPLC 法,检测对象主要集中于芝麻、芝麻油等样品,鲜有对食品添加剂进行相关研究的报道。鉴于此,本文在以往研究基础上,以涡旋混合辅助超声提取处理样品的方式,建立了气相色谱- 质谱内标法测定食用香精中芝麻酚的方法。该方法简便、灵敏、准确,适用于食用香精中芝麻酚的快速筛查、确认和测定。
    1 ·实验部分
    1. 1 仪器与试剂
    6890N/5975 气相色谱- 质谱仪( 美国Agilent 公司) ,配备7683 自动进样器、增强型化学工作站;HP - INNOWax 毛细管色谱柱( 30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm) ; TM - 1 旋涡混合器( 无锡沃信仪器有限公司) ; KQ - 500DE 超声波发生器( 昆山市超声仪器有限公司) ; 振荡器( 国华电器有限公司) ; TDZ4A -WS 离心机( 湘仪实验室仪器开发有限公司) ; 电子天平( Mettler Toledo 公司,感量0. 1 mg) ; 50 mL 离心管( Corning 公司,PP 材质) 。
    乙醇、环己烷、正己烷、二氯甲烷、甲醇( 色谱纯,德国Merck 公司) ; 异丙醇、甲苯( 分析纯,南京化学试剂公司) ; 芝麻酚( 标样,纯度≥98%) 、正十七碳烷( 纯度≥99%) 、反式茴香脑( 纯度≥99%) 、萘( 纯度≥99%) 、丙酸苯乙酯( 纯度≥98%) ,以上标样及备选内标均由Dr. Ehrenstorfer 公司提供。
    1. 2 分析方法
    1. 2. 1 标准工作溶液的配制内标储备液: 准确称取0. 2 g( 精确至0. 1 mg) 内标丙酸苯乙酯,用乙醇溶解并定容至100 mL,浓度约为2 000 mg /L; 内标溶液: 准确移取0. 1 mL 内标储备液,用乙醇定容至100 mL,浓度约为2 mg /L。
    一级标准储备液: 准确称取0. 1 g( 精确至0. 1 mg) 芝麻酚,用乙醇溶解定容至100 mL 容量瓶中,标样浓度约为1 000 mg /L; 二级标准储备液: 准确移取1 mL 一级标准储备液,用乙醇定容至100 mL容量瓶中,标样浓度约为10 mg /L; 标准工作溶液: 分别准确移取0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0、4. 0 mL二级标准储备液至10 mL 容量瓶中,再分别准确移取内标溶液各1 mL,用乙醇稀释定容、摇匀,配制6 级标准工作溶液待用。该系列标准溶液的质量浓度分别为0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0、4. 0 mg /L,内标为0. 2 mg /L。
    1. 2. 2 样品处理准确称取0. 5 g( 精确至0. 1 mg) 试样于50 mL 离心管中,准确移入1 mL 内标溶液,再加入9 mL 乙醇溶剂,用漩涡混合器分散均匀,再置于超声波发生器内超声萃取20 min,加入0. 5 g无水硫酸钠,摇匀后静置。试样于离心机内4 000 r /min 离心5 min,取上层清液过0. 45 μm 有机相滤膜,用GC - MS 进行分析。
    对于不分散于乙醇的试样,准确称取0. 5 g( 精确至0. 1 mg) 于50 mL 离心管中,加入1 mL 水,准确移入1 mL 内标溶液,用漩涡混合器分散均匀,再加入8 mL 乙醇溶剂,置于超声波发生器内超声萃取20 min,加入0. 5 g 无水硫酸钠,摇匀后静置。试样于离心机内4 000 r /min 离心5 min,取上层清液过0. 45 μm 有机相滤膜,用GC - MS 进行分析。
    1. 2. 3 色谱及质谱条件样口温度: 250 ℃; 进样量: 1 μL; 分流方式: 不分流进样; 色谱柱:
    DB - 5MS( 30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm) ; 程序升温: 初始温度80 ℃,以20 ℃ /min 升至150 ℃,再以5℃ /min 升至200 ℃; 传输线温度: 280 ℃; 电离方式: EI,电离能量为70 eV; 离子源温度: 230 ℃;四极杆温度: 150 ℃。
    定量分析: 采用选择性离子扫描模式,以特征离子进行定量分析,目标物芝麻酚的特征离子为138、52、80( 其中138 为定量离子) ,内标丙酸苯乙酯的特征离子为104、57、91( 其中104 为定量离子) ,对每个离子的监测时间为50 ms。
    定性确证: 试样待测液和标准品的选择离子色谱峰在相同保留时间处( ± 0. 2 min) 出现,且对应质谱碎片离子的质荷比与标准品一致,其丰度比与标准品相比符合: 相对丰度> 50% 时,允许± 10% 偏差; 相对丰度20% ~ 50%时,允许± 15%偏差; 相对丰度10% ~ 20%时,允许± 20%偏差; 相对丰度≤10%时,允许有± 50%偏差,此时可定性确证目标分析物。
    2· 结果与讨论
    2. 1 样品前处理条件的优化
    2. 1. 1 萃取溶剂的选择依据有机溶剂的不同极性,分别选取正己烷、环己烷、甲苯、二氯甲烷、乙醇及甲醇( 其极性系数分别为0. 06、0. 10、2. 40、3. 40、4. 30 和6. 60) 为萃取溶剂,以两个不同分散属性香精样品( 实测结果均未检出目标物) 的加标样品( 加标水平9. 5 mg /kg) 为分析对象,按照上述分析方法,每个样品平行测定2 次,取平均值作为提取效率的考察指标。检测结果见表1。
 
    从表1 可以看出,不论样品的分散性如何,弱极性的溶剂对芝麻酚的提取效率较差,而极性稍强的溶剂对芝麻酚的提取效率较好,综合考虑各种溶剂的毒性强弱,本实验选择乙醇作为最佳萃取溶剂。
    2. 1. 2 提取方式及条件样品分散的均匀性是影响食用香精样品中目标物提取的重要因素。考虑到香精样品来源非常广泛,样品基质差别较大,采用单一的提取手段较难满足各类样品分散的要求。为此,在参考相关文献的基础上[14],从以下两个角度确定试样的提取方式: ①基于香精样品在萃取溶剂中的溶解性,将样品进行分类处理,分类类型为能分散于乙醇的试样和不能分散于乙醇的试样; ②选择更为有效、简便的样品提取方式,即先采用涡旋混合方式将试样均匀分散于萃取溶剂中,再辅以超声或振荡提取的方式从样品基质中提取目标物。
    基于上述原由,以两个香精样品( 实测结果均未检出目标物) 的加标样品( 加标水平10 mg /kg) 为分析对象,按照上述分析方法,分别考察“涡旋混合+ 超声提取”和“涡旋混合+ 振荡提取”两种提取方式对目标物的提取效率,其中超声器功率设为50%,振荡器频率为160 r /min,提取时间分别设定为10、15、20、25、30、40 min,每个样品平行测定2 次,取平均值作为提取效率的考察指标,检测结果见表2。从表2 可以看出,不论样品的分散性如何,总体而言,“涡旋混合+ 振荡提取”处理方式对样品中芝麻酚的提取效率次于“涡旋混合+ 超声提取”处理方式,因此,本实验选择“涡旋混合+ 超声提取”的样品处理方式。根据表中的数据,考虑到目标物在两种不同分散属性基质中的提取效率,并结合操作效率因素,确定最佳提取时间为20 min。

    2. 1. 3 萃取体积的确定
    以两个不同溶解属性的加标样品( 加标水平10 mg /kg) 为对象,以乙醇为萃取溶剂,在不同萃取体积的条件下,进行提取效果试验,结果见表3。从表3 可以看出,对于不同溶解属性的样品,随着萃取体积的增加,样品中芝麻酚的提取结果变化不大,总体而言,当萃取体积为9mL 时,目标物的提取结果较好。对于不分散于乙醇溶剂的样品,使用水和内标溶液经涡旋混合使其充分分散。经实验,选择水的最佳用量为1 mL,乙醇的最佳用量为8 mL。

    2. 2 检测条件的优化
    2. 2. 1 内标的选择
    参考相关文献[14],以2 mg /L 的正十七烷、萘、茴香脑和丙酸苯乙酯为对象,分别考察其作为内标物时对检测结果的影响( 见图1) 。从图中可以看出: ①各备选内标物均能与目标组分完全分离,其中,保留时间依次由正十七烷、萘、茴香脑和丙酸苯乙酯渐近增大,峰宽也渐近增大; ②拖尾因子均接近1,不存在拖尾或前展现象,说明峰形的对称性良好。峰纯度分析未发现有杂质组分; ③从仪器定量下限分析,萘的灵敏度最高,丙酸苯乙酯次之,茴香脑和正十七烷较差。
          
    基于内标物的峰位置应尽可能与待测组分的峰位置靠近,但又能与待测组分完全分开的原则,结合仪器定量检出限[15],本实验采用丙酸苯乙酯作为内标物。
    2. 2. 2 特征离子的选择
    由于香精香料样品来源广泛,基体背景较复杂且目标物含量较低,在使用GC - MS 时,选择SIM 模式对样品进行分析。内标丙酸苯乙酯( CAS 号为122 - 70 - 3) 的质谱图如图2A所示,分子离子为178,但其丰度较小,基峰离子为104,紧随其后的特征离子为57、91,三者的丰度比为100 ∶ 25 ∶ 9,参照一般质谱定量特征离子选取原则( 即m/z 比大、相对丰度高、干扰离子少等) [16],确定特征离子为104、57、91( 其中104 为定量离子) ; 目标物芝麻酚( CAS 号为533 - 31 - 3)的质谱图如图2B 所示,由图可见,其分子离子也是基峰离子为138,丰度紧随其后的特征离子为52、80,三者的丰度比为100 ∶ 18 ∶ 10,因此,确定芝麻酚的特征离子为138、52、80( 其中138 为定量离子) 。
   
    2. 3 线性关系、检出限与定量下限
    在优化实验条件下,对系列标准溶液进行测定,以芝麻酚浓度与内标浓度之比为横坐标,以芝麻酚色谱峰面积与内标峰面积之比为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明,目标物在0. 1 ~ 4. 0 mg /L 质量浓度范围内具有良好的线性关系,线性方程为y = 0. 488x - 0. 010 7,相关系数( r2 ) 为0. 999 9。方法的检出限( S /N≥3) 为0. 26 mg /kg,定量下限( S /N≥10) 为0. 88 mg /kg。
    2. 4 回收率与精密度
    取两个不同分散属性的食用香精样品( 实测值为未测出) ,采用标准溶液对样品进行不同浓度水平的加标,考察其回收率情况,实验结果见表4。
            
    结果表明,目标物的平均加标回收率为97% ~104%,相对标准偏差( RSDs) 为1. 2% ~ 3. 9%。该方法的准确度和精密度可满足食用香精的分析要求。
    2. 5 实际样品的测定
    依据本文建立的测定方法,对购自南京市场的128 份食品香精进行测定,除了1 个样品检出芝麻酚( 含量为15. 90 mg /kg) 外,其余样品均未检出芝麻酚。
    3· 结论
    本文采用涡旋混合辅助超声波提取的样品处理方式,建立了气相色谱- 质谱内标法测定食用香精中芝麻酚含量的方法。方法具有前处理效率佳、选择性好、重复性高、定量准确等特点,且通过SIM扫描能有效地消除复杂基体干扰,适合于食品香精中芝麻酚的定性确证和定量测定。

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