8 种调味料提取液抑菌效果研究

来源：食品添加剂供求网发布时间： 10/24/2016 1:52:52 PM

食品在储藏和使用过程中难免受到微生物的污染。为延长食品保藏期，人们采用不同手段，使微生物丧失活性、延缓或阻止其生长，其中添加防腐剂是一种方便有效且被普遍采用的方法。目前所使用的食品防腐剂主要是化学防腐剂如苯甲酸、山梨酸及其盐类、对羟基苯甲酸酯等，尽管化学防腐剂对微生物有一定的抑制作用，但它们对食品的口感及人们的身体健康有不良影响，要求严格限制其在食品中的用量; 并且其防腐效果受溶解度、微生物种类、pH 值等因素影响［1 － 2］。因此研发使用方便、效果好且无毒副作用的天然防腐剂已受到世界各国的普遍重视［3］。
    天然调味料应用历史悠久，价格低廉，含有多种活性成分，具有广谱抗菌作用，不易产生抗药性。本课题将选取8种调味料( 丁香、八角、花椒、肉桂、藿香、肉豆蔻、高良姜、生姜) ，研究其对4 种常见致病菌和腐败菌( 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉) 的抑菌效果，以期发现具有良好防腐应用前景的天然香料，开发出天然食品防腐剂，达到既可防腐抑菌，又可提升食品风味的目的，大幅度提升食品品质和食品安全［2 － 3］。
    1 材料与仪器
    1． 1 供试材料
    丁香、八角、花椒、肉桂、藿香、肉豆蔻、高良姜、生姜均购自淮安市广济医药连锁有限公司。供试菌株为: 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，大肠杆菌Escherichia coli，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，黑曲霉Aspergillus niger。三种细菌由淮阴工学院生化学院提供，黑曲霉由淮安市质监局提供。
    1． 2 培养基
    牛肉膏蛋白胨培养基: 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5g，水1000 mL，pH 值7． 4 ～ 7． 6。固体培养基则加1． 5% ～ 2．0%琼脂。马铃薯葡萄糖培养基: 马铃薯( 去皮) 200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL。固体培养基则加1． 5% ～ 2． 0%琼脂。
    1． 3 仪器
    HH － 4 数显恒温水浴锅、DSX － 280B 不锈钢手提式灭菌器、BCM － 1000 超净工作台、DH3600 电热恒温培养箱、FW80 型高速万能粉碎机、超声波清洗仪、旋转蒸发仪、电炉、天平、牛津杯( 内径6mm，外径8 mm，高10 mm) 和其它实验室常用玻璃仪器等。
    2 方法
    2． 1 8 种调味料提取液制备方法［4 － 6］
    超声波提取法: 8 种调味料分别精密称取粉碎好的粉末4 g，分别放入100mL 三角烧瓶中，加食用乙醇16mL，浸泡6h后用超声波震荡20min( 超声功率为400W，温度为30℃) ，用旋转蒸发仪蒸发至4mL，用0． 45 μm 微孔有机滤膜过滤灭菌得到浓度为1g /mL 的提取液，备用。
    2． 2 菌种活化及菌悬液的制备
    菌种活化: 三种细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基斜面37℃培养20 h 进行活化; 黑曲霉采用马铃薯葡萄糖培养基平板28℃培养72 h 进行活化。
    细菌菌悬液的制备: 取活化好的细菌斜面，加3 mL 无菌水，用接种环轻轻刮下菌苔，制成菌悬液，血球计数板计数，再用无菌水调整其浓度为2． 0 × 108 个/mL，备用。黑曲霉孢子悬液的制备: 取活化好的平板，用无菌水洗涤其上的黑曲霉孢子，置于含玻璃珠的三角瓶中，在28 ℃下120 r /min 摇床振荡20 min，用4 层灭菌擦镜纸过滤振荡液，在显微镜下用血球计数板对滤液中孢子进行计数，调整其浓度至2． 0 ×108 个/mL，保存在4 ℃冰箱备用。
    2． 3 8 种调味料提取液抑菌活性测定［7 － 8］
    采用牛津杯法测定提取液抑菌活性。取浓度为2． 0 ×108 个/mL 的各种待测菌( 孢子) 悬液0． 1 mL，涂布在相应凝固平板上，之后每个平板放入1 个灭菌的牛津杯。分别用移液枪取8 种调味料提取液加入牛津杯中，细菌37 ℃培养24h、黑曲霉28 ℃培养48 h 后，移去牛津杯，测定抑菌圈直径，每组平行3 次，取其平均值。
    2． 4 8 种调味料提取液最低抑菌浓度( MIC) 测定［8］
    以浓度1 g / mL 的调味料提取液作为100% 原液，无菌水两倍法稀释，得不同浓度提取液系列。配制牛肉膏蛋白胨液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基，每小试管1960 μL分装， 121℃ 湿热灭菌，冷却后备用。准确移取40 μL2． 0 ×108 CFU/mL 测试菌液加入相应的小试管中，再加入倍比稀释的调味料提取液2000 μL，混匀，每个浓度做3 个平行。设置阳性对照( 加培养基和菌液，以食用乙醇代替调味料提取液加入小试管中) 和阴性对照( 加培养基和调味料提取液，不加菌液) ，细菌于37 ℃培养箱中培养24 h，黑曲霉于28 ℃培养48 h。肉眼观察试管浊度，以不显示浊度的最低药液浓度作为MIC。并从以上培养物中分别取0． 1 mL 涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基或马铃薯葡萄糖固体培养基平板上，于37 ℃或28 ℃培养后观察，以进一步验证上述试管法的肉眼观察结果。
    2． 5 8 种调味料提取液稳定性的研究［9］
    2． 5． 1 温度稳定性研究
    将调味料提取液放在40、80、100℃进行处理5 min 后，再进行抑菌圈的测定。
    2． 5． 2 紫外线稳定性研究
    将调味料提取液分别在紫外灯( 功率为20W) 下处理10、30、60min，再进行抑菌圈的测定。
    2． 5． 3 酸碱稳定性研究
    用0． 1 mol /L 盐酸和氢氧化钠调节调味料提取液的pH值分别为5、7、9，再进行其抑菌圈大小的测定。
    3 结果与分析
    3． 1 8 种调味料提取液的抑菌效果
    8 种调味料提取液的抑菌效果如下表1 所示，抑菌圈直径越大，抑菌活性越大。可以看出: 丁香的抑菌效果是最明显的，都达到了20 mm 以上，其次是肉桂，而藿香的抑菌效果是最不明显的，都在13mm 以下。8 种调味料除了丁香和肉桂之外对黑曲霉的抑制效果都比较弱。丁香具有较好的防霉作用，其主要抑菌成分为丁香酚，对食品中常见的腐败菌和产毒素菌的生长也有明显的抑制作用［10］。肉桂主要抑菌成分为肉桂醛，文献显示对真菌有显著疗效，对大肠杆菌、枯草杆菌及金黄色葡萄菌、白色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、伤寒和副伤寒甲杆菌、肺炎球菌、产气杆菌、变形杆菌、炭疽杆菌、肠炎沙门氏菌，霍乱弧菌等均有不同程度的抑制作用［11］。

    3． 2 8 种调味料提取液最低抑菌浓度( MIC) 测定
    8 种调味料提取液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和黑曲霉的MIC 测定结果如表2 所示。由表2 可知，丁香、八角和肉桂提取液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制作用最大，其MIC 为15． 625 mg /mL; 其次为花椒、高良姜、生姜，其MIC 为31． 25 mg /mL; 肉豆蔻和藿香的抑菌效果最差，其MIC 为62． 5 mg /mL。由表3 可知，丁香提取液对黑曲霉的抑制作用最大，其MIC 为15． 625 mg /mL; 其次为肉桂，其MIC 为31． 25 mg /mL; 八角、花椒、高良姜、肉豆蔻、藿香和生姜的抑菌效果较差，其MIC 为125mg /mL。


    3． 3 8 种调味料提取液稳定性的研究
    3． 3． 1 温度和紫外线稳定性
    不同温度和紫外线照射不同时间处理组抑菌实验结果如表4 和表5 所示。可以看出: 8 种调味料提取液经不同温度和紫外线照射不同时间处理后，其抑菌活性没有明显的变化，说明这些提取液中含有的抑菌物质对温度和紫外线具有较高的稳定性。


    3． 3． 2 酸碱稳定性
    pH 值对8 种调味料提取液抑菌活性的影响如表6 所示。可以看出: 将药液调制成碱性时，药液的抑菌效果减弱得非常明显，说明pH 值对药液的抑菌稳定性有一定影响。
    由此可见调味料提取液中的抑菌成分不耐碱，原因可能是碱处理可能会使某些抑菌成分与溶液中的碱发生反应，从而使该物质的抑菌性减小。

    4 讨论
    本实验采用的是超声波法提取8 种调味料中的抑菌成分，用食用乙醇作溶剂，该方法操作简单，便于优化，效果好。目前的提取方法除超声波提取法外，还有水煎法、浸渍法、渗漉法、回流法、水蒸汽蒸馏法、超临界流体萃取、微波提取、大孔吸附树脂法等［7 － 9］。在今后工作中，可比较不同方法得到的提取液的抑菌效果，为进一步开发食品防腐剂提供理论依据。
    本实验选用的8 种调味料具有独特的刺激性气味，能够矫正食品的异味，赋予香气，此外还有着色、抗氧化、抗菌( 防腐) 以及一系列的生理药理作用。本实验研究它们对常见致病菌与腐败菌的抑菌效果，结果显示8 种调味料对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为11 ～ 20mm，对枯草芽孢杆菌抑菌圈直径为12 ～ 27mm; 对大肠杆菌的抑菌圈直径为12 ～ 24mm，对黑曲霉的抑菌圈直径为6 ～ 22mm。其中丁香和肉桂对4种菌都有较好的抑菌效果。在实际应用中，可根据食品的配方，开发研制少用甚至不用合成防腐剂的天然食品。此外，本文只是初步研究了这8 种调味料提取液的抑菌性能，关于其具体抑菌物质的研究还不是很透彻，有待于进一步深入研究。另外还可考虑将几种中药抑菌成分复合，以达到更大适用范围和更好防腐效果。因为由栅栏技术( 是指在食品设计和加工过程中，利用食品内部能阻止微生物生长繁殖因素之间的相互作用，控制食品安全性的综合性技术措施) 可知，单一的防腐剂通常都存在着一定的缺陷，必须采用复合防腐技术，才能发挥互补和相乘效果，有效地阻止微生物的生长和其它不利因素，达到优势互补、相得益彰的目的。

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