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酶促腐乳生产过程中各种理化性质的变化研究

     腐乳古称乳腐,又称乳豆腐、豆腐乳。通过微生物的发酵作用提高生理活性物质的保健功效, 从而使腐乳具有更高的营养价值和保健功能[1-2]。传统腐乳的生产品质差、出品率低、周期长,制作时间及品质完全依靠人们的经验,没有严格标准,很难实现工业化生产。
    目前, 对酶促腐乳的研究多集中在对于腐乳制作过程中工艺参数的优化[3];或对于酶促腐乳制作过程中后酵阶段某一理化性质的测定,如对酶促腐乳制备过程中水溶性蛋白、大豆多肽含量和微观结构等的研究[4-6]。
    本文对酶促腐乳制备过程中的大豆蛋白水解度、总酸含量、脂肪含量、锥入度、抗氧化能力进行研究, 对于这种新型酶促腐乳的进一步推广应用及进行工业化的生产具有一定的意义。
    1· 材料与方法
    1.1 材料与仪器
    大豆,市售;乳酸菌LL-50A、蛋白酶制剂ACCELERZYMENP 50000(后简称蛋白酶制剂,酶活力为3000U/mL), 由荷兰DSM 公司上海代表处提供;雅致放射毛霉(Actinomucor elegans),天津科技大学生物工程学院;蛋白质消化仪,济南海能仪器有限公司;EDN-08A 型微量凯氏定氮仪, 上海光谱仪器有限公司;索氏抽提器,天津玻璃仪器厂;锥入度仪, 北京兰铂高科检测仪器有限公司;UV-2550PC型紫外可见分光光度计,日本岛津仪器公司。
    1.2 实验方法
    1.2.1 酶促腐乳的制备工艺流程
    豆浆→添加乳酸菌→添加酶制剂→凝乳→划块→压榨成型→接种毛酶→毛坯→水解→灭酶→后酵→腐乳
    (1)豆浆的制备:泡豆时豆水比为1∶3,浸泡时间为9h, 采用分离式磨浆机制备磨豆浆,95℃煮浆5min。
    (2)乳酸菌和酶制剂的添加量均为1%。
    (3)凝乳:待豆浆冷却后,加入乳酸菌及蛋白酶制剂,经搅拌后置于36℃培养箱中培养,待凝。
    (4)接种毛霉,制作毛坯:将白坯表面喷洒毛霉孢子液(孢子含量为1.0×106 个/mL), 然后放置在28℃培养箱中培养48h, 豆腐表面长出兔绒状白色毛霉,手工搓毛,制作毛坯。
    (5)水解:50℃水解5h。
    (6)灭酶:置于80℃条件下保持30min 灭酶。
    (7)后酵:经灭酶后放入汤料中,进行后酵。
    1.2.2 抗氧化测定样液的制备
    取自制腐乳块中间部分, 经真空冷冻干燥、粉碎, 用乙醚脱脂后, 备用。取经预处理后的样品2.50g, 加入50mL 50%乙醇后, 在室温下提取2h后,3000r/min 离心15min, 过滤得上清液为样品溶液,待抗氧化能力的测定使用。
    1.2.3 理化指标的测定
    (1)水解度(DH)的测定
    按式(1)计算水解度。
   
    式中:DH 为样品水解度,%;AN 为样品氨基态氮含量,g/100g;TPN 为样品总氮含量,g/100g。注:采用甲醛滴定法测定氨基酸态氮;采用凯氏定氮法测定总氮含量。
    (2)总酸的含量通过酸碱中和滴定(酸度计)法测定。
    (3)脂肪含量的测定[7]。
    (4)采用锥入度仪测定锥入度。
    测定条件如下:标准锥的椎体重量102.5g,锥杆重量47.5g;延迟时间0.1s;穿透时间5.0s。
    (5)腐乳抗氧化能力的测定DPPH 自由基清除能力的测定[8];羟基自由基清除能力的测定[9];还原能力的测定[10]。
    2· 结果与讨论
    2.1 酶促腐乳生产过程中大豆蛋白水解度的变化
    2.1.1 酶促腐乳水解过程中大豆蛋白水解度的变化
    将豆腐表面接种毛霉孢子菌悬液后,在28℃条件下培养2d 并搓毛,制成毛坯。毛坯在50℃条件下进行水解,定期取样,测定总氮含量和氨基酸态氮含量,并根据1.2.3(1)得到大豆蛋白水解度的变化趋势。结果如表1 所示。
   
    由表1 可知,水解过程中既没有氮的加入,也没有氮的流失,但由于水解过程中水分的变化,导致总氮含量发生变化; 在水解过程中大豆蛋白水解度逐渐升高;水解初期,蛋白酶制剂活力达到最大,蛋白质降解比较强烈,水解度显著提高;随着水解产物的不断增加,蛋白酶制剂的活力被抑制,水解度趋于平缓。
    2.1.2 酶促腐乳后酵过程中大豆蛋白水解度的变化
    由2.1.1 确定5h 后毛坯水解完毕, 待毛坯水解完毕后,置于75℃条件下20min 进行灭酶,将灭酶后的毛坯浸泡在红色腐乳汤料,进入后酵期。分别取后酵0d,5d,10d,15d,20d,25d,30d 的酶促腐乳坯体,测定总氮含量和氨基酸态氮含量,并根据1.2.3(1)得到大豆蛋白水解度的变化趋势。结果如表2 所示。
   
    由表2 可知,后酵过程中酶促腐乳的水分不断流失,故不同后酵时间的总氮含量不同,整体呈现上升趋势;酶促腐乳在后酵过程中,由于红曲汤料中蛋白酶与微生物的作用,大豆蛋白继续水解,水解度呈现上升趋势。随着水解产物的累积、酶活力的下降、原料的消耗,蛋白质水解作用减弱,蛋白水解度趋于平缓。后酵30d 时,氨基酸态氮含量为0.581g/100g,不低于红腐乳商业标准中对氨基酸态氮含量的要求。
    2.2 酶促腐乳生产过程中总酸含量的变化
    分别取白坯、毛坯及后酵0d,5d,10d,15d,20d,25d,30d的酶促腐乳坯体,测定总酸含量。结果如图1 所示。
   
    由图1 可知,酶促腐乳在生产过程中总酸的含量总体上呈上升趋势。白坯接种毛霉后,形成毛坯,由于接种的毛霉分泌出少量的酶系,如酸性蛋白酶,且部分蛋白质水解产生一些酸性氨基酸,因而使总酸含量增加。水解过程中也主要因为酸性氨基酸的增加使总酸含量增加。而在后酵过程中,由于汤料的隔离作用,使得酶促腐乳呈缺氧状态,产生乳酸。同时,汤料中的微生物分泌了大量的淀粉酶和脂肪酶,使大豆中的碳水化合物和脂肪分解成有机酸和脂肪酸,从而使总酸含量增加。而后酵20d 后的酶促腐乳总酸含量略有下降, 主要原因在于酶促腐乳内部发生酯化反应,消耗部分酸类化合物。
    2.3 酶促腐乳生产过程中脂肪含量的变化
    分别取白坯、毛坯及后酵0d,5d,10d,15d,20d,25d,30d 的酶促腐乳坯体,测定脂肪含量。结果如图2 所示。
   
    由图2 可知, 酶促腐乳生产过程中脂肪含量逐渐降低。白坯接种毛霉后,由于毛霉分泌脂肪酶将脂肪进行分解,因此毛坯中脂肪含量略有降低。水解过程中, 适宜的温度提高了脂肪酶活力, 促进脂肪分解。而后酵过程脂肪的水解是酶促腐乳中脂肪降低的主要原因。在后酵后期,由于酶解产物的不断生成和汤料中食盐的渗入,降低了汤料中脂肪酶的活性,脂肪含量趋于平缓。
    2.4 酶促腐乳生产过程中锥入度的变化
    分别取白坯、毛坯及后酵0,5,10,15,20,25,30d的酶促腐乳坯体,测定锥入度。结果如图3 所示。
    
    由图3 可知,白坯表现为锥入度高,硬度小。毛霉孢子接种在白坯表面后,在适宜条件下毛霉迅速生长繁殖。菌丝体匍匐在豆腐坯表面,生长均匀,逐渐形成较结实的被膜,不易破碎。与白坯相比,毛坯的锥入度减小,硬度增大,表明深入到白坯内部的菌丝体对锥入度的影响程度小于被膜。而水解过程中,蛋白水解剧烈,内部结构破坏,因此锥入度增大,硬度减小。后酵过程中,腐乳的锥入度逐渐升高,硬度逐渐减小,主要是因为大豆中的蛋白质在汤料中相关酶的作用下降解,从而使硬度降低。因此,酶促腐乳在生产过程中的锥入度先减小后增大,硬度先增大后减小。
    2.5 酶促腐乳生产过程中抗氧化能力的变化
    分别取白坯、毛坯及后酵0d,5d,10d,15d,20d,25d,30d 的酶促腐乳坯体。根据实验方法1.2.2 制备样液,分别测定DPPH 自由基清除能力、羟基自由基清除能力及还原能力,结果分别如图4、图5 和图6所示。
   
    
    由图4 可知, 酶促腐乳生产过程中DPPH 自由基清除率逐渐升高,这与全明海等[17]研究的传统腐乳自由基清除能力的变化结果一致。DPPH 自由基清除率在酶促腐乳后酵15d 基本上达到最大,为80.48%。
    由图5 可知, 酶促腐乳生产过程中羟基自由基清除率逐渐升高。羟基自由基清除率在后酵25d 基本上达到最大,为21.41%。
    由图6 可知, 酶促腐乳在生产过程中的还原能力是逐渐升高的, 说明后酵时间长的酶促腐乳更易凭借其还原能力,作为电子供体与自由基反应,使之转换为更稳定的物质, 从而达到中断自由基链式反应。
    综上所述, 酶促腐乳生产过程中抗氧化能力是逐渐提高的。
    3· 结论
    研究发现酶促腐乳生产过程中大豆蛋白水解度和总酸逐渐增大,脂肪含量逐渐降低,而硬度先增大后减小。后酵30d 酶促腐乳的蛋白水解度为34.39%,总酸含量为3.50g/100g,脂肪含量为20.36g/100g,锥入度为234.7×10-1mm。以清除DPPH·、清除·OH 及还原能力测定评价抗氧化能力得出酶促腐乳在制作过程中抗氧化能力逐渐提高。

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