低芳香成分姜黄素超声提取技术研究
姜黄为多年生草本，隶属被子植物门、单子叶植物纲、姜科，是姜黄属植物中的一个品种[1]，其性温，味辛、苦，入脾、肝经，具有行气破淤、通经止痛之功效[2]。姜黄的主要化学成分为挥发油和姜黄素。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分[3]。姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素等二苯基庚烃物质往往同时存在与体系中[4]。姜黄素易溶于甲醇、乙醇、碱和冰醋酸，微溶于水、苯和乙醚等[5]。在酸性和中性溶液中显黄色，在pH大于9.0的碱性溶液中显红色[6]。姜黄素具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、防止衰老和延年益寿等诸多功效，成为近年来天然药物中的研究热点。已有人将姜黄素用于AIDS患者及HIV感染者的治疗[7]。姜黄素还是一种优良的着色剂，其染色力大于其他天然色素和合成柠檬黄等，尤其是对蛋白质等有很强的染色能力[8]。目前，对提取姜黄素的研究很多，提取方法主要有有机溶剂提取法、超声提取法等[9]。
测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法等。姜黄挥发油的主要成分为姜烯、姜黄酮、芳姜黄酮等组分，具有特殊的香味[10]。挥发油的提取方法一般有水蒸气蒸馏法[11-12]、微波辅助水蒸气蒸馏法[13]、超临界流体萃取技术和溶剂提取法[14]。检测方法为分光光度法与气相色谱法。超声波可使植物细胞形态发生变化，破坏细胞壁，使细胞中的物质更容易提取出来[15]。为了研究超声波对姜黄素提取效果的具体影响，在姜黄根茎进行超声前后，将其在扫描电子显微镜下进行观察[16-17]。本论文的主要研究超声技术下提取得到低芳香成分姜黄素的有效方法，所以重点研究了采用何种方法能够使去除挥发油效果更好，同时对姜黄素的提取影响更小。
1 ·材料与方法
1.1 材料与仪器
姜黄根茎北京普生霖药业有限公司；无水乙醇、石油醚、乙醚均为分析纯，北京化工厂；去离子水北京工商大学。
ALC-1100.2型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；UVmini-1240型紫外可见分光光度计上海棱光技术有限公司；FW-100型高速万能粉碎机北京中兴伟业仪器有限公司；砂石筛（1mm孔径） 沈河向上公司；JXD-02型超声浸取装置北京金星超声波设备技术有限公司；恒温水浴装置宁波新芝生物科技股份有限公司；AG 22331型移液枪Eppendorf公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验方案
1.2.1.1 先提姜黄素再提挥发油（方案一）
先用高速万能粉碎机将姜黄根茎粉碎，过孔径1mm的砂石筛；用电子天平准确称量姜黄粉末20.00g，倒入烧杯中，再在烧杯中加70%乙醇，将其放入超声设备中，进行姜黄素的提取，然后进行过滤，取滤液舍去滤渣，将滤液稀释100倍，在425nm下测姜黄素的吸光度，将滤液至于60~70℃恒温水浴锅中，将乙醇挥干，石油醚、乙醚按照设定的条件分别在超声设备中从胶状物即姜黄素中提取挥发油，提取装置为带有冷凝管的循环提取装置，最后过滤，将滤液在台式真空离心浓缩机内进行浓缩，称量得到挥发油的重量，滤渣用70%乙醇再次定容到500mL，稀释100倍，测其吸光度。研究时间影响时，固定料液比为20g姜黄粉末和200mL溶剂，时间变量分别为1、1.5、2、2.5、3h。研究溶剂体积影响时，固定时间2h，姜黄粉末20g，溶剂体积分别为：100、150、200、250、300mL。
1.2.1.2 先提挥发油再提姜黄素（方案二）
用高速万能粉碎机将姜黄根茎粉碎，过孔径1mm的砂石筛；用电子天平准确称量姜黄粉末20.00g，倒入圆底烧瓶中，倒入相应的石油醚或乙醚溶剂，插好冷凝管，进行挥发油的提取，过滤后将滤液在台式真空离心浓缩机内进行浓缩，测定挥发油的重量；挥干滤渣，将滤渣放入烧杯中，姜黄素的提取测定方法同1.2.1.1。研究时间影响时，固定料液比20g姜黄粉末和200mL溶剂，时间变量分别为1、1.5、2、2.5、3h。研究溶剂体积影响时，固定时间2h，姜黄粉末20g，溶剂体积分别为：100、150、200、250、300mL。
1.2.2 姜黄素的检测方法
姜黄素标准曲线溶液的配制：分别配制0.017007、0.013605、0.010204、0.006803、0.003401mmol/L浓度的姜黄素，测其在425nm下的吸光度。500mL 70%乙醇提取完姜黄素，经过滤后，准确吸取提取液0.5mL，注入50mL的容量瓶中用70%的乙醇定容即稀释100倍，用10mm比色杯，在波长425nm处，以相对应浓度的乙醇作参比，测定吸光度。
1.2.3 挥发油的检测方法
1.2.3.1 气相色谱质谱法
GC条件：HP-5MS毛细管色谱柱（0.25mm×30m，0.1μm）；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；进样口温度280℃，分流进样，分流比50∶1。色谱柱升温程序：初始柱温为70℃，以10℃/min升至250℃，维持5min。MS条件：离子源EI，电离能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，扫描质量范围为30~550amu。
1.2.3.2 重量法测定挥发油
将含有挥发油的有机溶剂在离心浓缩仪中浓缩到只剩挥发油，先称出离心管的重量，再称油与管的总重，相减得到挥发油的重量。溶剂为石油醚时在50℃下浓缩1.5h，溶剂为乙醚时在20℃下浓缩1h。
1.2.4 超声前后的电子显微镜观察
将姜黄原料浸于70%浓度的乙醇中，在频率20kHz，功率500W的超声场下常温作用30min，在1000倍的电子显微镜下观察其细胞形态变化。
2 ·结果与分析
2.1 时间对提取的影响
2.1.1 提取挥发油
由图1可知，对石油醚和乙醚而言，从提取液中萃取得到挥发油的量，相对于直接提取得到挥发油量的31.3%和87.0%，即先提取挥发油后提取姜黄素方法的提油效果优于先提姜黄素后提挥发油的提油效果；乙醚对挥发油的提取量比石油醚的提取量高109.9%以上，可达1.21g/h。这可能是由于乙醚的极性大于石油醚，对脂溶性成分溶解性更好，从气相色谱检测可以确定乙醚提取的为姜黄中的挥发油成分。两种溶剂对挥发油的提取量均随时间的延长而提高，且逐渐趋于平稳。
2.1.2 提取姜黄素
2.1.2.1 先提姜黄素后提挥发油方法
由图2可知，经石油醚和乙醚萃取后，姜黄素的提取量为直接提取姜黄素提取量的32.0%和11.7%，说明萃取对姜黄素影响很大；两种溶剂相比，石油醚的提取效果略优，比乙醚萃取后姜黄素的提取量高97.7%以上，为0.16mg/h。说明石油醚对姜黄素损失的影响小一些；直接提取和石油醚萃取后提取量与提取时间成正比，而乙醚萃取后的提取量与提取时间成反比。
2.1.2.2 先提挥发油后提姜黄素方法
由图3可知，经石油醚提取挥发油后再提姜黄素所得姜黄素的量为直接提取姜黄素量的88.9%，达0.787mg/h。说明石油醚对姜黄素的提取影响不大；而经乙醚提取挥发油后，再提取姜黄素，得到的量远远小于直接提取的量为36.9%，说明乙醚影响姜黄素的提取效果，降低了姜黄素的提取量；提取所得姜黄素的量与时间成正比，且到达一定程度后，趋于稳定，不再随时间的延长而增加。与图2对比可知，从姜黄素的提取效果看，先提挥发油后提姜黄素方法优于先提姜黄素后提挥发油方法，姜黄素产量高361.4%以上；直接提取和石油醚萃取后提取得到姜黄素的量随时间的延长而增加，而乙醚萃取后，姜黄素的量随着时间的延长而略有降低。
2.2 溶剂体积对提取的影响
2.2.1 提取挥发油
由图4可知，相同体积下，从提取液中萃取得到的挥发油为石油醚直接提取的35.1%，说明对于石油醚来说先提挥发油后提姜黄素方法的提油效果好于先提姜黄素后提挥发油方法；对于乙醚来说，溶剂体积低于200mL时，直接提取量为萃取得到量的72.9%，但随着体积的增大，萃取的量大于直接提取量，为提取量的112.0%，高达5.23g/L。相同体积下，乙醚比石油醚提取量高43.2%以上；两种溶剂的提取效果均随体积的增加而提高。
2.2.2 提取姜黄素
2.2.2.1 先提姜黄素后提挥发油方法
由图5可知，经石油醚和乙醚萃取过后，再提姜黄素时提取量为直接提取的18.2%和6.7%以下，明显低于直接提取的量且姜黄素损失随溶剂体积的增大而增长；两种溶剂相比，石油醚萃取后对姜黄素的提取影响小一些；直接提取和石油醚萃取后提取的效果与溶剂体积成正比，而乙醚萃取后的提取量与体积的增长成反比。
2.2.2.2 先提挥发油后提姜黄素方法
由图6可知，相同体积下，石油醚萃取后提取量为直接提取量的92.3%，而乙醚萃取后的提取量远小于直接提取量，为直接提取的36.9%以下，说明乙醚对姜黄素的提取影响大，而石油醚对其的影响很小；三种方法的提取量均随着溶剂体积的增大而增加。
2.3 气相色谱质谱分析
图7可知，17min左右处的峰为姜黄素，15~16min处的峰为挥发油（主要为姜黄酮，姜烯）。
2.4 电镜观察超声前后姜黄细胞形态变化
从图8可看出，超声前后姜黄细胞的形态发生了明显的变化。细胞壁破损，一些纤维物质被破坏，细胞内的物质露在表面，所以说超声提高了物质的提取率。
3· 结论
本实验研究了超声辅助溶剂提取法去除姜黄中的挥发油，得到低芳香成分姜黄素的有效方法。经过对实验数据的分析得到，姜黄素和挥发油的提取量，在一定时间范围内均随时间的延长而增大，随溶剂体积的增大而增大。先提挥发油再提姜黄素比先提姜黄素再提挥发油的提油量高36.1%以上，可达1.21g/h，且姜黄素的产量高361.4%以上，为0.787mg/h。乙醚提取挥发油的效果优于石油醚，但乙醚萃取后姜黄素的产量很小，仅为石油醚萃取后姜黄素产量的52.7%以下，为直接提取姜黄素产量的32.1%以下，使姜黄素损失很大。而石油醚对后续姜黄素的提取影响较小。所以，以姜黄素为目标产物提取时，宜使用石油醚为提取剂，以挥发油为目标产物提取时，则使用乙醚作为提取剂效果更好。
姜黄素具有非常广泛的药理活性，如抗氧化、抗衰老等，同时还是很重要的天然色素。但姜黄中挥发油的独特气味限制了姜黄素在一些方面的应用。本实验研究提取低芳香成分的姜黄素技术，让其能更广泛地应用在化妆品、食品等领域。